酵母细胞的细胞壁比较厚，不容易破壁，不如大肠杆菌的质粒容易提取，最近做了些酿酒酵母的实验，从酿酒酵母中提取质粒，现在就总结下实验的方法和步骤。

酵母细胞质粒提取步骤

1. 接种单菌落(待检测酵母细胞)于25mLYNB(补加氨基酸营养物)培养基中，30℃振荡培养过夜。

2.第二天取一滴菌液于进行显微镜下观察,目镜用16,物镜用40倍观察细胞壁破碎前的状态,其成杆状,流动性比较下.

3.取10ml的培养酵母菌液,5000g离心3min,弃上清液.加入5ml的1倍TE悬浮.

4.将悬浮液倒入高压破壁仪的样品管中,利用高压破碎机进行破碎细胞壁,压力加到20Mpa,停留15s,降压,反复来回压3次.取出细胞液,取一滴于显微镜下观察,如果细胞呈不规则的球状时,而且其流动性 比较大,说明其细胞壁已经破碎成为原生质体.

5.取2个EP管,每管加入1.5ml上述的细胞液,12000g离心5min,收集原生质体.弃取上清液,每管加入300ul10%的SDS溶液,混匀冰浴5min,进行破原生质体.

6.然后加入150ul的tris饱和酚,和150ul的卤仿异戊醇混合液(卤仿:异戊醇=24:1),混匀,12000g,离心10min.

7.将水相移到另一EP管中,加入等体积的卤仿异戊醇混合液(卤仿:异戊醇=24:1), 混匀,12000g,离心10min.

8. 将水相移到另一EP管中,加入1/10体积的3M KAC溶液和2倍体积的无水乙醇,放入-20℃冰箱中

9.1h,12000g离心10min,倒出乙醇,等干燥后加入1ml的70%的无水乙醇,混匀,12000g,离心10min.

10.弃去乙醇,等室温干燥后,每管加入20ul的TE溶液(如要去处RNA酶,加入1ul的100mg/ml浓度的RNA酶),放入-20℃冰箱即可.

11.跑电泳进行检测是否从酵母菌中提出质粒了.

酵母破壁方法

我给你介绍两个必叫简单点的酵母破壁方法，非常实用，我作过很多实验，这两个方法是我自己总结出来的，希望对你有用。

酵母的细胞壁比较厚,不易破，而且细胞壁中含有的一些成分容易影响以后的实验，所以破壁的步骤非常关键!其他步骤只要你按照说明就可以了。

1. 酚氯仿剧烈振荡方法破壁：培养好的1ml酵母细胞在STE溶液中洗涤两次后，用70ulTE缓冲液重旋!加入50ul玻璃珠(sigma公司)，加入80-100ul酚氯仿，剧烈振荡5-10分种后，使用氯仿抽取去除酚和蛋白，然后按照其他步骤沉淀就可以得到你的质粒，DNA的提取也可以使用这种方法。

2.反复冻融破壁：培养好的1ml酵母细胞在STE溶液中洗涤两次后，加入200ul缓冲液[2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0)]，使用液氮和96-98度沸水反复冻融3-5次，然后使用酚氯仿抽提蛋白!其余步骤参考其他文献

酵母质粒提取可以用试剂盒提取。