实验步骤

一、材料准备

1.  仪器：净化工作台、 离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。

2.  玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、 培养瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、废液缸。

3.  塑料器皿： 吸头、枪头、胶塞、移液管（10ml）、15ml离心管、冻存管（1～2ml）。

4.  其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。

5.  试剂：D-Hanks液、小牛血清、培养液、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油。

二、细胞冻存

1.  配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液。

2.  取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中。

3.  离心1 000 rpm，5 min。

4.  去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml。

5.  将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml。

6.  在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。

7.  冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

三、 细胞复苏

1.  从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2.  从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。

3.  离心， 1 000 rpm，5 min。

4.  弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养。

5.  次日更换一次培养液，继续培养。

注意事项

1.  从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液。

2.  将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤。
 

3.  冻存和复苏最好用新配制的培养液。

其他

一、冻存和复苏的原则：慢冻快融

当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。

如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

二、慢冻程序

1.  标准程序：采用细胞冻存器

当温度在-25 ℃以上时，  1~2 ℃/min；

当温度达-25 ℃以下时， 5~10 ℃/min；

当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中。

2.  简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1~2 ℃的速度，在40 min内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。

3.  传统程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→ -20℃ 30 分钟→ -80℃ 16~18 小时（或隔夜） → 液氮槽长期储存。

三、低温保护剂的应用

在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。

常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。

四、细胞冻存方法

1.  预先配制冻存液

（1）10%DMSO + 细胞生长液（20%血清+基础培养液）

（2）10%甘油+ 细胞生长液（20%血清+基础培养液）

2.  取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液， 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ~ 5 ×106细胞/ml）。

3.  加入1 ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。液氮长期保存。

五、保存细胞的复苏方法

1.  快速解冻

冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。

2.  解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO。

3.  如果细胞对冷冻保护剂特别敏感

解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。